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          CELLSCRIPT™體外加帽試劑盒工作原理

           發布時間:2022-03-03 點擊量:221

          CELLSCRIPT™的使命是提供安全高效的轉錄產品和技術,用于制造和使用RNA以便進行臨床研究和治療的細胞翻譯。

          目前的產品包括多種體外轉錄試劑盒、加帽類似物或加帽酶的5' RNA加帽試劑盒和3' RNA多聚腺苷酸化的試劑盒,以及用于轉錄、加帽、poly(A)尾mRNA以進行翻譯的多合一試劑盒。

          其中,ScriptCap™ Cap 1 Capping System(C-SCCS1710)包含ScriptCap加帽酶、ScriptCap 2'-O-甲基轉移酶、GTP和SAM等成分,對體外轉錄的RNA進行轉錄后加帽修飾。Cap 0或Cap 1上限均可構建,效率接近100%(這不能通過共轉錄加帽方法來完成)。

          ScriptCap加帽酶在體外催化具有5‘-三磷酸基的初級RNA的5’末端加成帽核苷酸?!懊焙塑账?或“帽"是一種鳥嘌呤核苷,它通過5‘C連接到一個三磷酸基團,然后再連接到初級mRNA轉錄本中最多的5’核苷酸的5‘碳上,在大多數真核生物中,帽核苷酸中鳥嘌呤7位的氮是甲基化的。表示為:m7G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3')。其中m7G代表N7-甲基鳥嘌呤核苷,PPP代表帽子核苷的5’碳與初級RNA轉錄本的第一個核苷酸之間的三磷酸橋,N1(PN)x-OH(3’)代表初級RNA轉錄本,其中N1是最多的5’核苷酸。

          ScriptCap加帽酶可依次催化三種不同的酶反應:

          (1) RNA三磷酸酶將RNA的5‘三磷酸裂解成二磷酸:

          pppN1(p)Nx-OH(3')——ppN1(pN)x-OH(3') + Pi

          (2) RNA鳥苷酸轉移酶將GTP連接到RNA最5‘核苷酸(N1)的5’二磷酸上:

          ppN1(pN)x-OH(3') + GTP——G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + PPi

          (3) 鳥嘌呤-7-甲基轉移酶以S-腺苷甲硫氨酸(SAM或ADOMet)為輔因子,催化帽核苷酸中鳥嘌呤7-氮的甲基化:

          G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + AdoMet——m7G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + AdoHyc

          這一過程被稱為“蓋帽",與未蓋帽的RNA相比,它提高了RNA的穩定性和翻譯效率。ScriptCap蓋帽酶構建的封端RNA產物具有“0"帽結構。在體外,通過同時使用ScriptCap 2‘-O-甲基轉移酶和ScriptCap蓋帽酶,可以將CAP0 RNA轉化為“CAP1"結構。

          ScriptCap 2‘-O-甲基轉移酶通過將供體分子SAM上的甲基轉移到CAP 0 RNA倒數第二個核苷酸的2’-O位,從CAP 0-RNA制備CAP1-RNA,合成具有CAP 1結構的RNA。

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          Cap1 RNA可以進一步提高mRNA的體內翻譯效率,并有助于將mRNA標記為相對于細胞內免疫監視機制的“自身RNA"。

          ScriptCap1蓋帽系統提供了一種在IVT反應中通過共轉錄蓋帽來制造蓋帽RNA的替代方案,在IVT反應中,用二核苷酸蓋帽類似物(例如m7GpppG)代替部分GTP,如果RNA的5‘末端不是結構化的,使用ScriptCap 1蓋帽系統的蓋帽效率可以接近100%。相反,由于CAP類似物與GTP競爭RNA聚合酶的轉錄啟動,共轉錄的蓋帽效率受到CAP類似物的濃度及其與GTP濃度之比的限制。因此,在轉錄反應中使用CAP類似物蓋帽的RNA百分比總是小于100%。在使用CAP類似物的共轉錄蓋帽反應中可以產生的CAP RNA的量也受到降低GTP濃度以允許CAP類似物競爭轉錄起始的需要的限制。另一方面,如果要蓋帽的RNA具有高度結構的5‘末端,則與CAP類似物共轉錄蓋帽可能是有益的。

          優勢:靈活進行cap0和cap1的加帽;

             效率極高,接近100%;

             同類產品可直接交叉使用以及價格合適。

          應用:進行體外mRNA的修飾,用作體外蛋白表達系統和生理試驗;

             前體mRNA的研究試驗以及疫苗研究。



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